Cell：单细胞测序揭示重症COVID-19以髓系细胞失调为标志 |单细胞专题

期刊名称：Cell
影响因子：66.85发表时间：2020所用组学：质谱细胞仪（CyTOF）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和多色流式细胞仪（MCFC）

研究背景

对支气管肺泡灌洗样本的单细胞研究表明，重症COVID-19患者存在复杂的肺免疫反应失调，全身性炎症与不利的临床病程和严重COVID-19的发展有关。SARS-CoV-2感染诱导特异性T细胞和B细胞反应，这体现在SARS-CoV-2肽特异性T细胞的升高和SARS-CoV-2特异性抗体的产生等方面。多项研究和常规临床观察表明，重症COVID-19中中性粒细胞增加，非经典单核细胞(CD14^loCD16^hi)减少。严重感染和败血症中常见严重的免疫失调，其特征是从高炎症状态发展到免疫抑制，对于严重的COVID-19也提出了类似的机制。然而，对重症COVID-19免疫病理学的了解仍然很不清楚。

实验设计

队列1：柏林队列，基于液滴的单细胞平台（10x Chromium），通过质谱细胞仪（CyTOF）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）进行分析；

队列2：波恩队列，通过多色流式细胞仪（MCFC）和基于微孔的scRNA-seq系统（BD Rhapsody）进行分析；

scRNA-seq分析了53名COVID-19患者和56名对照样本，其中包括8名FLI患者。 

研究结果

01评估COVID-19患者免疫改变的双中心队列研究

首先，作者利用 CyTOF 技术对轻中症、重症不同疾病进程的新冠肺炎患者的免疫细胞进行研究，UMAP分析显示，来自COVID-19患者、FLI和健康对照组的样本具有明显的聚类特征，单核细胞和粒细胞发生明显变化（图1C）。所有主要谱系的比例都高度相似。此外，作者观察到重症COVID-19患者白细胞升高和中性粒细胞比例增加（图1D）。所有COVID-19和FLI患者的总淋巴细胞和T细胞均显著减少，而非经典单核细胞在COVID-19患者中特异性减少（图1D）。在队列2中，通过MCFC验证了严重COVID-19中中性粒细胞的增加和轻度和重度疾病中非经典单核细胞的丢失。因此，SARS-CoV-2感染与淋巴细胞减少和髓系细胞的改变有关。

图1：单细胞多组学分析

Tips：上图可通过联川星云进行绘制

02COVID-19患者中髓系细胞的特征

通过新冠肺炎患者血液样本进行单细胞测序，共鉴定出五个不同的clusters （clusters 0-4），不同病程患者体内的转录本表达量呈现显著性差异（图2A）；clusters 0-3单核细胞表达CD14， clusters 4由FCGR3A标记的非经典单核细胞组成。在轻度和重度病例中，也显示了高度疾病严重程度特异性的群集（图2B）。在轻症COVID-19患者中，以HLA-DRA、HLA-DRB1和共刺激分子CD83的高表达为标志的CD14+单核细胞（簇1）（图2A-C），其参与与抗原特异性T细胞的延长扩张有关。作者还发现了CD14+HLA-DR^hi单核细胞群（簇2），其特征是IFN刺激基因（ISGs）的高表达（图2A-C）。此外在重症COVID-19患者体内鉴定到表达CD24、PGLYRP1、DEFA3 和 DEFA4的中性粒细胞（簇6）表达和表达 FCGR3B(CD16b)、CXCL8 和 Lcn2（Lipocalin 2）的成熟的嗜中性粒细胞（簇5），它们在PBMC内的密度梯度迁移标志着这些细胞为低密度中性粒细胞(LDNs)。该结果得到了队列2的验证。在两组COVID-19患者中检测到疾病严重程度依赖的单核细胞改变和两种LDNs的出现。

图2：来自两个独立队列患者的PBMC的scRNA-Seq

Tips：上图可通过联川星云进行绘制

03轻症患者HLA-DR^hiCD11c^hi炎症性单核细胞和重度患者HLA-DR^lo CD11c^lo CD226+CD69+单核细胞的特征

单核细胞特别容易受到COVID- 19的影响，表现为CD14^loCD16^hi非经典单核细胞的丢失（图1C和1D）。通过scRNA-seq鉴定了单核细胞激活的疾病严重程度依赖性变化。作者进一步利用CyTOF对COVID-19患者、FLI患者和年龄和性别匹配对照的全血样本探究了单核细胞的表型改变。一共将单核细胞和DCs细胞分成12个主要细胞簇（图3A和B），经典的CD14^hiCD16单核细胞表现出高度的异质性，可分为7个主要亚群。大多数经典单核细胞均显示出CD38、CD95和CXCR3的高表达。COVID-19患者的单核细胞与FLI患者和对照组分别聚类。FLI患者和轻度COVID-19患者的HLA-DR^hiCD11c^hi细胞比例较高，反映了重症COVID-19中单核细胞激活延迟（图3A-D）；在重症COVID-19中，CD226和CD69（簇10）表达增加和/或HLA-DR表达降低，这是在巨噬细胞分化过程中被诱导产生的。因此，经典单核细胞的另一种激活模式似乎是COVID-19特异性的，并与疾病的严重程度相关。总之，这种激活模式可能有助于COVID-19中循环单核细胞的减少。

图3：CD11c^lo和HLA-DR^lo和CD226⁺CD69⁺单核细胞

Tips：上图可通过联川星云进行绘制

04HLA-DR^lo单核细胞在重症COVID-19中持续存在

接下来，作者通过scRNA-seq分析了COVID-19相关的单核细胞表型改变。HLA-DR低表达和S100A12和CXCL8高表达为标志的单核细胞簇（簇3，HLA-DR^loS100A^hi）与重症COVID-19密切相关（图2B）。进一步作者对队列2的PBMC数据集的单核细胞进行了再分群分析，共鉴定到7个亚群（图4A）。此外，从COVID-19患者中分离出的血液单核细胞对LPS刺激的细胞因子反应迟钝，特别是来自严重COVID-19患者的单核细胞（图4D）。这表明HLA-DR^lo单核细胞簇（0、2和6）几乎只在严重的COVID- 19中检测到（图4E）。

接下来，作者分析了队列2中每个患者的时间依赖性簇占比（图4E，F）。在所有轻症COVID-19病例中均发现了活化的HLA-DR^hiCD83^hi单核细胞（簇1）。相比之下，HLA-DR^loCD163^hi单核细胞（簇2）主要存在于重症疾病早期，而HLADR^loS100A^hi单核细胞（簇0）主要存在于疾病晚期。ISG表达水平在早期时间点最高，并随着时间的推移持续下降，这清楚地表明COVID-19中的IFN反应与疾病的严重程度和时间呈负相关。相比之下，重症COVID-19患者中HLA-DRA和HLA-DRB1的表达在早期就明显下降，并持续了一段时间。综上所述，单核细胞表型的动态变化与COVID-19疾病的严重程度和发病时间相关。

 图4：与疾病相关的单核细胞转录组纵向变化

Tips：上图可通过联川星云进行绘制

05COVID-19重症患者体内出现低密度中性粒细胞，揭示髓系细胞形成

来自重症COVID-19患者血液样本的PBMCs包含两个不同的LDN簇。LDNs在队列1中出现的频率略高，作者对这些细胞进行了更详细的分析，一共鉴定到了8个簇（图5A）。

在COVID-19患者的中性粒细胞中高表达（图5E），ARG1+细胞主要为未成熟中性粒细胞（簇3-6），与CD274（PD-L1）表达细胞没有重叠，表明重症COVID-19中有不同群体的功能障碍和潜在抑制中性粒细胞。从COVID-19患者的LDNs簇分析揭示了功能失调的中性粒细胞的存在，并指出了在重症COVID-19中激活的多种潜在的有害途径。

图5：在PBMC中出现了未成熟和功能障碍的低密度中性粒细胞

Tips：上图可通过联川星云进行绘制

06重症COVID-19患者中激活的中性粒细胞前体和PD-L1+中性粒细胞的持续增加

对中性粒细胞的无监督聚类分析显示了一共鉴定到了未成熟的（簇2、5、6和7）、成熟的（簇1、3和4），以及低丰度的簇（簇8、9和10)共10个簇。在UMAP分析中，COVID-19患者的中性粒细胞与对照组和FLI患者明显分离（图6B），重症COVID-19患者的中性粒细胞与轻度疾病患者不同。相比之下，重症COVID-19与未成熟的前中性粒细胞和前中性粒细胞的出现相关（图6D和6E）。且重症COVID-19中的未成熟细胞簇显示出近期激活的迹象，如CD64的上调和CD62L下调。与对照组相比，来自重症COVID-19的未成熟和成熟中性粒细胞的PD-L1表达升高（图6E）。CD62L下调和PDL1高表达经常与中性粒细胞和粒细胞髓系来源的抑制细胞（gMDSCs）的抑制功能相关。

因此，SARS-CoV-2感染诱导中性粒细胞的改变。虽然FLI患者中的中性粒细胞显示出成熟的激活表型，但释放具有免疫抑制和功能障碍表型迹象的未成熟中性粒细胞是重症COVID-19的标志。

接下来，作者评估了髓系细胞随时间的动态变化。作者们观察到重症COVID-19中未成熟中性粒细胞（如簇6）的持续释放，显示CD64和PD-L1的高表达和CD62L的下调，可作为激活、功能障碍和免疫抑制的标志。此外，重症COVID-19患者在后期出现成熟的、部分激活的中性粒细胞（簇3）的频率进一步增加。因此，重症COVID-19患者的中性粒细胞具有持续的炎症和免疫抑制的特征。

图6：重症COVID-19患者未成熟和PD-L1+中性粒细胞的出现

Tips：上图可通过联川星云进行绘制

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